دانلود پایان نامه:تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای بر بیان ژن­های اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش

دانلود پایان نامه

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست­ شناسی

گرایش :سلولی- مولکولی

عنوان : تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای بر بیان ژن­های اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش

وزارت علوم، تحقیقات و فناوری

پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست­ فناوری

پژوهشکده زیست­ فناوری پزشکی

 

پایان­نامه كارشناسی‌ ارشد

در رشته زیست­ شناسی سلولی- مولکولی

 

عنوان:

تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای بر بیان ژن­های

اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش

اساتید راهنما:

دکتر مجتبی دشتی­زاد

دکتر قاسم آهنگری

 

استاد مشاور:

دکتر مهدی شمس­آرا

 

اسفند ماه سال 1393

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

1     مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده2

1-1     تکوین پیش از لانه­گزینی در موش3

1-1-1    لقاح.. 3

1-1-2     تکوین اولیه. 5

1-1-3     مکانیسم­های مولکولی دخیل در لایه­زایی رویان. 9

1-1-3-1     جدایی دو رده­ی سلولی تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی.. 10

1-1-3-2     جدایی دو رده­ی سلولی اپی­بلاست و اندودرم اولیه. 11

1-2     تکنیک­های کمک باروری13

1-2-1     لقاح آزمایشگاهی.. 13

1-2-1-1      کیفیت سلول تخم. 14

1-2-2     کشت آزمایشگاهی رویان. 15

1-2-3     انجماد. 16

1-2-3-1     اصول انجماد. 17

1-2-3-2     مواد سرما محافظ.. 18

1-2-3-3     روش­های انجماد. 19

1-2-3-3-1     انجماد آهسته. 20

1-2-3-3-2     انجماد شیشه­ای.. 21

1-2-4     سوراخ کردن مصنوعی.. 22

2     مواد و روش­ها…………………..25

2-1     حیوان.25

2-2     تولید رویان آزمایشگاهی26

2-2-1     استحصال اسپرم. 26

2-2-1-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 26

2-2-1-2     جابجایی مهره­ی گردنی.. 27

2-2-1-3     تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم. 28

2-2-1-4     جمع­آوری و ظرفیت­پذیری اسپرم. 29

2-2-2     استحصال تخمک… 31

2-2-2-1     تحریک تخمک­گذاری.. 31

2-2-2-1-1      تزریق داخل صفاقی.. 31

2-2-2-2     آماده­سازی محیط و قطره­ها 32

2-2-2-3     جابجایی مهره­ی گردنی.. 32

2-2-2-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­ی تخم­بر. 32

2-2-2-5     جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس… 33

2-2-3     لقاح آزمایشگاهی.. 34

2-2-3-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 34

2-2-3-2     لقاح.. 35

2-2-4     کشت آزمایشگاهی.. 35

2-2-4-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 35

2-2-4-2     کشت رویان. 36

2-3     تولید رویان درون­تنی37

2-3-1     تحریک تخمک­گذاری و جفت اندازی موش­ها 37

2-3-2     آماده­سازی محیط و قطره­ها 37

2-3-3     جابجایی مهره­ی گردنی.. 37

2-3-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­های رحمی.. 37

2-3-5     استحصال بلاستوسیست… 38

2-4     سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست39

2-4-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 39

2-4-2     آماده­سازی و تنظیم دستگاه ریز­دستکاری.. 40

2-4-3     روش کار. 40

2-5     انجماد رویان41

2-5-1     انجماد شیشه­ای.. 41

2-5-1-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 41

2-5-1-2   روش کار. 42

2-5-2        یخ­گشایی.. 43

2-5-2-1     آماده­سازی محیط و قطرات… 43

2-5-2-2   روش کار. 44

2-6     بررسی بیان ژن.45

2-6-1     استخراج RNA از بلاستوسیست… 45

2-6-2     ساخت cDNA.. 46

2-6-3      طراحی پرایمر. 47

2-6-4     رقیق­سازی پرایمرها 47

2-6-5     واکنش زنجیرهای پلیمراز. 48

2-6-6     ژل الکتروفورز محصولات PCR.. 49

2-6-7     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 49

2-7     طراحی آزمایش52

2-7-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه­ای52

2-7-2     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه­ای..52

2-7-3     آنالیز آماری.. 52

3     نتایج.54

3-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه­ای……………54

3-1-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 54

3-1-2     بیان نسبی ژن­های Gata6 و Grb2. 56

3-1-2-1     واکنش زنجیرهای پلیمراز. 56

3-1-2-2     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 57

3-2      کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه­ای.62

3-2-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 62

3-2-2     بیان نسبی ژن­های Gata6 و Grb2. 64

4     بحث و نتیجه­گیری67

5     فهرست منابع..76

6     پیوست­ها83

فهرست جداول

جدول ‏1‑1: ترکیبات محیط HTF. 14

جدول ‏1‑2: ترکیبات محیط KSOM.. 16

جدول ‏2‑1: محلول­های مورد نیاز برای انجماد شیشه­ای بلاستوسیست موش.. 42

جدول ‏2‑2: محلول­های مورد نیاز برای یخ­گشایی بلاستوسیست موش.. 44

جدول ‏2‑3: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA. 46

جدول ‏2‑4: چرخه­های حرارتی ساخت cDNA. 46

جدول ‏2‑5: مشخصات پرایمرهای طراحی شده 47

جدول ‏2‑6: مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز 48

جدول ‏2‑7: چرخه­های حرارتی مراحلPCR 48

جدول ‏2‑8: مواد مورد نیاز جهت انجام Real Time PCR. 50

جدول ‏2‑9: چرخه­های حرارتی Real Time PCR. 50

جدول ‏3‑1: میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست درون­تنی موش.. 55

جدول ‏3‑2:  میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست برون­تنی موش. 63

فهرست اشکال

شکل ‏1‑1: مراحل مختلف تکوین پیش از لانه­گزینی در موش.. 2

شکل ‏1‑2: بخش­های مختلف لوله­ی تخم­بر. 3

شکل ‏1‑3: فرایند گامت­زایی. 4

شکل ‏1‑4: اسپرم و تخمک پستانداران. 5

شکل ‏1‑5: قطبیت رویان موش. 6

شکل ‏1‑6: تقسیم مرحله­ی 8 به 16 سلولی. 7

شکل ‏1‑7: تشکیل حفره­ی بلاستوسل. 7

شکل ‏1‑8: آرایش سیستم­های انتقالی در سلول­های تروفواکتودرم 8

شکل ‏1‑9: بلاستوسیست در حال خروج از زونا 9

شکل ‏1‑10: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش. 10

شکل ‏1‑11: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپی­بلاست در سه مرحله 11

شکل ‏1‑12: دخالت مسیر پیام­رسان FGF/MAPK 13

شکل ‏1‑13: فرایند شیشه­ای شدن محیط انجماد. 21

شکل ‏1‑14: روش­های مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفره­ی بلاستوسل. 24

شکل ‏2‑1: قفس­های دارای سیستم تهویه­ی مجزا 26

شکل ‏2‑2: پتری دیش استحصال اسپرم 27

شکل ‏2‑3: جابجایی مهره­های گردنی. 28

شکل ‏2‑4: تشریح موش نر 29

شکل ‏2‑5: جمع­آوری اسپرم 30

شکل ‏2‑6: نحوه­ی جمع­آوری اسپرم­های زنده از حاشیه­ی قطره­ی محیط کشت.. 30

شکل ‏2‑7: نحوه­ی ترزیق داخل صفاقی موش.. 31

شکل ‏2‑8: پتری دیش استحصال تخمک.. 32

شکل ‏2‑9: جداسازی لوله­ی تخم­بر. 33

شکل ‏2‑10: جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس.. 34

شکل ‏2‑11: پتری دیش IVF. 34

شکل ‏2‑12: تخمک-کومولوس­های مجزا 35

شکل ‏2‑13: نحوه­ی قطره­گذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان. 36

شکل ‏2‑14: جداسازی لوله­های رحمی. 38

شکل ‏2‑15: استحصال بلاستوسیست از لوله­ی رحمی. 39

شکل ‏2‑16: پتری دیش ریز دستکاری. 40

شکل ‏2‑17: نحوه­ی سوراخ کردن حفره­ی بلاستوسیست.. 41

شکل ‏2‑18: نحوه­ی قطره­گذاری محلول­های انجماد شیشه­ای. 42

شکل ‏2‑19: موقعیت قرار گیری بلاستوسیست بر روی کرایوتاپ 43

شکل ‏2‑20: پتری دیش حاوی محلول یخ­گشایی. 44

شکل ‏3‑1: بلاستوسیست­های درون­تنی موش بعد از انجماد-ذوب در محیط KSOM.. 56

شکل ‏3‑2: الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز. 57

شکل ‏3‑3: منحنی استاندارد ژن­های Grb2، Gata6 و B2m 58

شکل ‏3‑4: منحنی تکثیر ژن­های Grb2، Gata6 و B2m. 59

شکل ‏3‑5: منحنی­های ذوب مربوط به ژن­های Grb2، Gata6، B2m. 60

شکل ‏3‑6: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Gata6. 61

شکل ‏3‑7: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Grb2. 62

شکل ‏3‑8: مراحل مختلف رشد و تکوین رویان موش پیش از لانه­گزینی. 63

شکل ‏3‑9: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Gata6. 64

شکل ‏3‑10: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Grb2 65

چکیده فارسی

مطالعات انجام شده در سال­های اخیر نشان می­دهند که سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد شیشه­ای، در بهبود کیفیت رویان­های ذوب شده موثر است. اما در این مطالعات، به نقش آب درون حفره و تاثیر آن بر روی تشکیل رده­های سلولی بلاستوسیست، توجه نشده است. بنابراین در تحقیق حاضر، علاوه بر ارزیابی نرخ زنده­مانی و خروج از زونا، اثر کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای، بر روی میزان بیان ژن­های Gata6 و Grb2 در بلاستوسیست درون­تنی و برون­تنی منجمد-ذوب شده و سوراخ شده قبل از انجماد بررسی شد و با گروه کنترل مقایسه گردید. در این مطالعه، میزان خروج از زونا با سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد، به­صورت     معنی­داری افزایش یافت. این در حالی است که میزان زنده­مانی در گروه­های تحت تیمار، مشابه با گروه کنترل، بالا بود. انجماد شیشه­ای موجب افزایش در میزان بیان ژن­های Gata6 و Grb2 شد (p<0.05). اما با کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد، در بلاستوسیست­های درون­تنی، میزان بیان این ژن­ها نسبت به گروه انجماد شیشه­ای به­صورت معنی­داری کاهش پیدا کرد و به گروه کنترل نزدیک شد (p<0.05). در حالی که در مورد بلاستوسیست­های برون­تنی، با استفاده از این تکنیک، بیان ژن Grb2 افزایش پیدا کرد ولی تفاوت معنی­داری در میزان بیان ژن Gata6 نسبت به گروه انجماد شیشه­ای ایجاد نشد. از   آن­جایی که هیچ نتیجه­ای مبنی بر تاثیر منفی استفاده از این تکنیک مشاهده نگردید و با توجه به افزایش میزان خروج از زونا، کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه­ای می­تواند مفید واقع شود.

کلمات کلیدی: لقاح آزمایشگاهی، انجماد شیشه­ای، سوراخ کردن مصنوعی، بیان ژن، Real Time PCR

مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده

تکوین قبل از لانه­گزینی[1]، در همه­ی پستانداران با یک سلول منفرد به نام تخم[2] آغاز می­شود و با ایجاد بلاستوسیست[3] از طریق چندین تقسیم متوالی، پایان می­یابد (Rossant and Tam, 2009). مطالعه در مورد رخداد­های این دوره، برای افزایش موفقیت در تکنیک­های کمک باروری[4] الزامی است. بیشتر اطلاعات ما درباره­ی تکوین قبل از لانه­گزینی، از مطالعه بر روی موش بدست آمده است. از مزایای استفاده از موش می­توان به تعداد نژادهای بسیار زیاد، تشابه ژنتیکی بالا با انسان، ارزان بودن گونه­ی موش نسبت به سایر گونه­ها، دوران بارداری کوتاه، تعداد زیاد نوزادان در هر دوره­ی بارداری، سایز کوچک و نگهداری آسان اشاره کرد. بر همین اساس، استفاده از این مدل آزمایشگاهی در تحقیقات مربوط به فرایند­های تولیدمثلی و تکنیک­های کمک باروری رایج می­باشد.

تعداد صفحه : 103

قیمت : 14700تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  *** ***