سایت مقالات فارسی – بررسی تنوع ژنتیکی شگ ماهی خزری Alosa braschnikowi broodine, 1904 در سواحل …

۲- محتویات ویال ها توسط سمپلر خوب هم زده و ترکیب شد تا بخوبی همگن شوند.

۸-۳- بهینه سازی PCR

ابتدا با دادن دامنه حرارتی به دستگاه ترموسایکلر بهترین دمای اتصال هر کدام از آغازگرها به رشته الگو به دست آمد و در مرحله بعد جهت تظاهر خوب باندها و حذف باندهای اضافی تکثیر شده، غلظت Mgcl2 بهینه سازی گردید. مقدار Mgcl2 بین ۵/۰ تا ۱ میلیمولار تغییر داده شد تا بهترین وضوح باندها بهدستآید.

۹-۳- الکتروفورز محصول PCR، با استفاده از ژل پلی آکریل آمید ۶%

محصول نهایی PCR با استفاده از ژل اکریلآمید ۶% بررسی شد.
مواد مورد نیاز: آب مقطر دو بار تقطیر شده، آکریل آمید، بافر TBE(10X)، آمونیوم پرسولفات، TEMED، بافر سنگین کننده، نشانگر (Ladder) bp100 (ساخت شرکت MBI Fermentase) جهت تعیین وزن آللها.
وسایل مورد استفاده:
دستگاه الکتروفورز عمودی.نمونهبردار با توانایی نمونهبرداری ۲۰ میکرولیتر.

۱۰-۳- روش تهیه ژل آکریل آمید

در داخل یک بشر ابتدا ۵/۲۳ میلیلیتر آب مقطر با ۶ میلیلیتر اکریلآمید (۳۰ درصد) و ۳ میلیلیتر TBE(10X) مخلوط شدند. سپس ۵/۲۷ میکرولیتر محلول TEMED و ۲۵۳ میکرولیتر APS به محلول داخل بشر اضافه گردید و به سرعت خوب همگن شدند. سپس محلول نهایی را به فضای محصور بین دو شیشه مخصوص که قبلا تهیه شده بود، به آرامی منتقل گردید تا حباب ایجاد نشود. سپس شانههای ایجاد کننده چاهک در جای خود قرار گرفتند. پس از بسته شدن ژل (حدود ۳۰ دقیقه) شانهها را برداشته و چاهکای ایجاد شده را با بافر TBE(1X) خوب شستشو میدهیم؛ بهگونهای که هیچ ذرهای از قطعات ژل احتمالی روی چاهکها نماند. نمونههای حاصل از محصول نهایی PCR در موقع تزریق به چاهکها ابتدا هر کدام با ۲ میکرولیتر بافر سنگین کننده خوب مخلوط شدند و سپس به ترتیب در محل چاهکها ریخته شدند. یکی از چاهکها در هر ژل اختصاص به Ladder دارد. ژل در ستون عمودی بافر حاوی TBE(1X) قرار گرفت و با روشن نمودن دستگاه و تنظیم مولد برق آن بر روی ولتاژ ۲۰۰ ولت، الکتروفورز نمونهها به مدت ۴ ساعت انجام شد.
شکل ۴-۳- تصویری از دستگاه الکتروفورز عمودی مورد استفاده در مطالعه حاضر

۱۱-۳- رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید با روش نیترات نقره

مواد مورد استفاده: آب مقطر دوبار تقطیر، اتانول ۹۶%، اسید استیک، نیترات نقره، NaOH، NaBH4، فرمالدهید.
تجهیزات مورد استفاده: شیکر، ترازوی دیجیتال با دقت ۰۰۱/۰ گرم، ظروف رنگ آمیزی.
روش کار:
بافر A: برای ساخت بافر A، ۴۰ میلی‌لیتر اتانول و ۲ میلی‌لیتر اسید استیک و ۳۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر استفاده شد. بافر B شامل مقدار ۳/۰ گرم نیترات نقره در ۲۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر بود. برای ساخت بافر C، ابتدا ۵/۴ گرم سود را در ۳۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل کرده و سپس ۰۳/۰ گرم NaBH۱% به آنها اضافه گردید و در نهایت ۲ میلی‌لیتر فرمالدهید به محلول اضافه شد. برای رنگ آمیزی، به مدت ۷ دقیقه ژلها را در بافر A قرار داده، سپس بافر A را تخلیه کرده و ۱۰ دقیقه در بافر B شستشو داده و سپس ژل دو بار در آب مقطر سرد شستشو گردید. سرانجام ژل در بافر C قرار داده شد تا باندها ظاهر شوند. در نهایت بافر C دور ریخته و ژل بین دو ورق پلاستیکی شفاف بستهبندی شد.

۱۲-۳- ثبت تصاویر

پس از رنگآمیزی ژل، تصویر با کیفیتی از آن توسط دستگاه مستندساز ژل (Gel Doc XR, BIO-RAD) تهیه شد. سپس با استفاده از نرمافزار ژل پرو آنالایزر Gel pro analyser 3.0. Gene, USA)) وزن باندهای مشاهده شده در باند اصلی در مقایسه با مارکر الگو (Ladder) مشخص گردید. سپس باندهای حاصل در کل نمونهها از اندازه کوچک به بزرگ شماره‌دهی شد. بدین ترتیب آللهای حاصل کدگذاری گردیدند.
شکل ۵-۳- تصویری از دستگاه مستند ساز ژل

۱۳-۳- آنالیز آماری

به منطور محاسبه تعداد آلل در هر یک از جایگاههای ژنی، هتروزیگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار، شاخص شانون و همچنین آزمون انحـراف از تعادل هاردی- واینبرگ و از نرم افزار GenAlex 6.41 (پیکال و اسموس، ۲۰۰۶) استفاده شد. ظرفیت اطلاعات چند شکلی هر نشانگر با استفاده از نرم‌افزارver 3.0.3 Cervus بهدست آمد (بوتستین و همکاران، ۱۹۸۰). همچنین جهت بررسی وجود آلل نول، خطاهای دسته‌بندی و یا از دست دادن آلل بزرگ، نرمافزارMicrochecker 2.2.1 (اوسترهوت، ۲۰۰۴) مورد استفاده قرار گرفت. از آزمون منویتنی غیر پارامتریک در نرم‌افزارSPSS ver 19 (زر، ۱۹۹۹) به منظور تعیین معنیدار بودن اختلاف در مقادیر هتروزیگوسیتی مشاهده شده (Ho) و مورد انتظار (He) استفاده شد. با استفاده از نرم افزار FSTAT ver 2.9.3 آنالیز غنای آللی، میزان ضریب درون آمیزی (Fis) و سطح معنیداری آن مشخص گردید (گودت، ۲۰۰۱). میزان تنوع درون و بین منطقهای و همچنین میزان تمایز بین مناطق بر اساس معیار مدل آللی بینهایت (Fst) و مدل جهش پله‌ای (Rst) توسط آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) در نرمافزارGenAlex محاسبه شد (پیکال و اسموس، ۲۰۰۶). همچنین میزان آلل واقعی (Na)، آلل مؤثر (Ne)، جریان ژنی (Nm) و فراوانی اللی[۲۶] نیز در همین نرمافزار بهدست آمد (پیکال و اسموس، ۲۰۰۶) تست عدم تعادل پیوستگی (disequilibrium linkage) بین جفت جایگاههای ژنی توسط نرم افزار GENEPOP 3.1 (ریموند و روزت، ۲۰۰۳) صورت پذیرفت. مقادیر فاصله ژنتیکی (D) و شباهت ژنتیکی براساس شاخص نئی[۲۷] (I) با استفاده از تست مربع لاتین (X2) محاسبه شد (نئی، ۱۹۷۸) و با استفاده از تست منتل[۲۸]، رابطه ب

برای دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت  jemo.ir  مراجعه نمایید.

ین فاصله جغرافیایی و فاصله ژنتیکی بررسی گردید. همچنین رسم دندروگرام UPGMA در نرم افزار Ver 2.02e NTSYSpc (یه و همکاران، ۱۹۹۹) بر اساس شباهت ژنتیکی بهدست آمده از شاخص نئی صورت پذیرفت.
فصل چهارم
نتایج
۴- نتایج

۱-۴- نتایج حاصل از بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراجی از شگماهی براشنیکوی در مطالعه حاضر

کیفیت DNA استخراجی با استفاده از روش الکتروفورز افقی ژل آگاروز یک درصد و کمیت آن با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین گردید. باندهای تشکیل شده در ژل آگاروز یک درصد دارای وضوح و شدت قابل قبول بودند که این موضوع نشاندهنده پایین بودن میزان آلودگیهای فنولی، پروتئینی و یا آلودگی ناشی از RNA است؛ در نتیجه امکان استفاده از آنها برای تکثیر در واکنش زنجیرهای پلیمراز وجود داشت (شکل ۱-۴). همچنین نتایج حاصل از بررسی کمیت DNAهای استخراجی از ماهیان مورد مطالعه در دستگاه نانودراپ نیز نشان داد که نسبت جذب در طول موج ۲۶۰ نانومتر به طول موج ۲۸۰ نانومتر در بازه ۲-۸۵/۱ بود و برای نمونههایی که این نسبت کمتر بود عمل استخراج DNA تکرار گردید. غلظت DNA در تمامی نمونهها ۵۰ تا ۷۰ نانوگرم بود.
شکل ۱-۴- تصویری از ژل آگارز یک درصد و باندهای تشکیل شده از DNA بر روی آن

۲-۴- نتایج حاصل از واکنش زنجیرهای پلیمراز

بهترین دمای الحاق نشانگرهای مورد استفاده، تعداد آلل و دامنه آللی مشاهده شده در هر یک از جفت نشانگرهای مورد استفاده در تحقیق حاضر در جدول ۱-۴ آورده شده است. در این تحقیق هر شش جایگاه ژنی ریزماهواره استفاده شده حالت پلی مورفیسم نشان دادند (اشکال ۲-۴ تا ۷-۴) و نتایج حاصل از ظرفیت اطلاعات چندشکلی (PIC) میزان بالایی از چندشکلی را در جایگاههای ژنی مورد استفاده نشان داد (جدول ۲-۴). همچنین هیچ یک از جایگاههای ژنی عدم تعادل پیوستگی از خود نشان ندادند (۶۸۴/۰P=).
جدول ۱-۴- جایگاه‌های ژنی مورد استفاده در این مطالعه و خصوصیات آنها

جایگاه ژنی کد دسترسی در بانکژنی NCBI تعدادآلل اندازه آلل توالی پرایمر (۵) دمای‌الحاق (۰c)