دانلود فرمت word : پایان نامه ارشد رشته رشته زیست شناسی : بررسی ارتباط پیوستگی بین هموگلوبین D و انواع هاپلوتیپ­های مجموعه ژنی بتاگلوبین

با عنوان : مطالعه ارتباط پیوستگی بین هموگلوبین D و انواع هاپلوتیپ­های مجموعه ژنی بتاگلوبین

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

دانشگاه آزاد اسلامي

واحد دامغان

دانشكده علوم زیستی

پايان‌نامه براي دريافت درجه كارشناسي ارشد در رشته زيست‌شناسي

 گرايش ژنتيك

 عنوان

مطالعه ارتباط پیوستگی بین هموگلوبین D و انواع هاپلوتیپ­های مجموعه ژنی بتاگلوبین در افراد مازندرانی

استاد راهنما

دکتر محمدرضا مهدوی

استاد مشاور

دکتر رضا نظام زاده

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی گردد

تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن می باشد هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود اما در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل می باشد)

فهرست مطالب

عنوان     صفحه

چکیده 1

فصل اول: مقدمه

1ـ1 اظهار مسئله: 3

1ـ1ـ1 هموگلوبین.. 3

1ـ1ـ2 ساختمان هموگلوبین.. 3

1ـ1ـ3 اظهار تکوینی هموگلوبین.. 5

1ـ1ـ4 ساختمان زنجیره گلوبین.. 7

1ـ1ـ5 خوشه ژنی آلفاگلوبین.. 7

1ـ1ـ6 خوشه ژنی بتاگلوبین.. 8

1ـ1ـ7 ناهنجاري هاي هموگلوبين در بشر. 8

1ـ1ـ8 اختلالات هموگلوبینهای انسانی.. 9

1ـ1ـ9 واریانت هاي ساختمانی زنجیره گلوبین.. 9

1ـ1ـ10 بیماری هاي سنتز زنجیره هموگلوبین.. 12

1ـ1ـ11 تالاسمی.. 12

1ـ1ـ12 مروری برهموگلوبینوپاتی های نادر گزارش شده در ایران. 12

1ـ1ـ13 هموگلوبین D.. 15

1ـ1ـ14 هاپلوتیپ.. 17

1ـ1ـ15 هاپلوتیپ های مجموعه ژنی بتاگلوبین.. 18

1ـ2 اهداف.. 19

1ـ2ـ1 هدف کلی طرح: 19

1ـ2ـ2 اهداف فرعی طرح: 19

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را در شماره بندی انتهای صفحه بخوانید

1ـ2ـ3 اهداف اختصاصی طرح: 19

1ـ2ـ4 اهداف کاربردی طرح: 20

1ـ2ـ5 فرضیههای طرح: 20

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2ـ1 پیش زمینه. 22

2ـ2 تحقیقات و نتایج گذشته. 22

فصل سوم: مواد و روش­ها

3ـ1 مواد و روشها 28

3ـ1ـ1 مواد، تجهيزات و لوازم مورد بهره گیری 28

3ـ1ـ1ـ1 لیست دستگاهها و لوازم مورد بهره گیری برای اجرای این پایان نامه در جدول 3-1 آمده می باشد. 28

3ـ1ـ1ـ2 مواد. 28

3ـ1ـ1ـ2ـ1 مواد مصرفی عمومی.. 28

3ـ1ـ1ـ2ـ2 مواد مصرفی شیمیایی.. 29

3ـ1ـ1ـ2ـ3 مواد مصرفی بیولوژیک… 29

3ـ1ـ1ـ2ـ4 محلولها 30

3ـ1ـ1ـ2ـ4ـ1 محلولهای لازم جهت استخراج.. 30

3ـ1ـ1ـ2ـ4ـ2 محلولهای لازم جهت واکنش PCR.. 30

3ـ1ـ1ـ2ـ4ـ3 محلول های لازم جهت الکتروفورز کردن DNA.. 31

3ـ1ـ2 روشها: 32

3ـ1ـ2ـ1 بیماران مورد مطالعه. 32

3ـ1ـ2ـ2 استخراج DNA ژنومی به روش نمک اشباع. 32

3ـ1ـ2ـ3 تعيين كميت و كيفيت DNA استخراج شده 34

3ـ1ـ2ـ4 واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR). 35

3ـ1ـ2ـ5 تهيه ژل آگارز و الكتروفورز محصولات PCR.. 36

3ـ1ـ2ـ6 رنگ آميزي با اتيديوم برمايد و عکسبرداري از ژل. 37

فصل چهارم: نتایج

4ـ1 نتایج.. 39

4ـ1ـ1 جمعیت مورد مطالعه. 39

4ـ1ـ2 مطالعه نتایج شناسایی هموگلوبین D.. 40

4ـ1ـ3 مطالعه نتایج جایگاههای مجموعه ژنی بتاگلوبین: 41

4ـ1ـ4 بررسي جهش‌ها به روش حضور و يا عدم حضور جايگاه شناسايي آنزيم محدودكننده (RFLP). 43

4ـ1ـ5 مطالعه هفت جایگاه درمجموعه ژنی بتاگلوبین به منظورشناسایی هاپلوتیپها توسط تکنیکRFLP-PCR : 44

4ـ1ـ6 واکاوی دادهها 45

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5ـ1 بحث.. 49

5ـ2 نتیجه گیری.. 52

5ـ3 پیشنهادات.. 52

فهرست منابع. 53

منابع فارسی: 53

منابع انگلیسی: 53

Abstract 57

چکیده

مقدمه: هموگلوبين دی – پنجاب يکي از انواع هموگلوبينوپاتي ها می باشد كه در آن جهش در موقعيت 121 بر روي زنجيره بتا رخ داده می باشد. اين اختلال هموگلوبين در هندوستان، پاكستان و ايران شايع مي باشد.افراد هتروزیگوت برای این بیماری غالباً بدون علامت بالینی خاصی می باشند، در حالی که در حالت هتروزیگوت مرکب با هموگلوبین S افراد مبتلا، کم خونی داسی شکل را بروز می دهند. مطالعه قبلی درشمال کشور نشان داد که تمامی واریانت های هموگلوبین دی درساری از نوع دی – پنجاب می باشند اما نوع هاپلوتیپ های همراه این واریانت شناخته نشده بود. هدف از این مطالعه شناسایی انواع هاپلوتیپ های همراه هموگلوبین دی در مجموعه ژنی بتاگلوبین بوده می باشد.

مواد و روش­ها: در مطالعه حاضر تعداد 18 نفر از خانواده های افرادی که دارای هموگلوبین دی – پنجاب بوده اند انتخاب گردیدند و DNA ژنومی از تمامی افراد با بهره گیری از روش استاندارد نمک اشباع استخراج گردید. سپس نوع هاپلوتیپ همراه هموگلوبین دی – پنجاب با بهره گیری از تکنیک PCR-RFLP و واکاوی پیوستگی در خانواده مشخص گردید.

نتیجه: مطالعه حاضر نشان داد که در 17 خانواده از 18 خانواده مطالعه شده آلل هموگلوبین دی با هاپلوتیپ    

– + +]- – – +[ پیوستگی دارد. و در تنها یک خانواده نیز آلل دارای هموگلوبین دی به همراه هاپلوتیپ[- + + – + + +] دیده گردید.

بحث و نتیجه­گیری: مطالعه ما نشان داد بخش عمده واریانت هموگلوبین دی – پنجاب در ساری دارای منشاء یگانه می باشند و هاپلوتیپ نادر دیده شده احتمالا یا منشاء ژنتیکی متفاوتی دارد یا در اثر مکانیسم هایی از قبیل نوترکیبی ژنی به وجود آمده می باشد

کلید واژه: هموگلوبین دی-پنجاب، هاپلوتیپ، PCR-RFLP، ساری

1ـ1 اظهار مسئله:

1ـ1ـ1 هموگلوبین

نام هموگلوبین از واژه هم و گلوبین گرفته شده می باشد که هر واحد هموگلوبین دارای پروتئین گلوبولار با گروه هم می باشد و هر گروه هم در برگیرنده یک اتم آهن می باشد که می تواند با یک مولکول اکسیژن از طریق نیروی دو قطبی آهن ترکیب گردد ( پروتز[1]،1960). این پروتئین که ناقل اکسیژن در خون می باشد برای اولین بار توسط هانفیلد در سال 1840 کشف گردید و همچنین برای اولین بار تأثیر هموگلوبین در خون توسط فیزیولوژیست فرانسوی کلود برنارد مشخص گردید (هانفیلد[2]1840). عمومی ترین نوع هموگلوبین در پستانداران شامل چهار زیر واحد می باشد . هموگلوبین مهمترین وفراوانترین پروتئین موجـود در گلبول های قرمز بوده و تأثیر اساسی در حمل ونقل اکسیژن ودی اکسیدکربن و پروتون دارد (پروتز،1960).

1ـ1ـ2 ساختمان هموگلوبین

مولکول هموگلوبین همانطورکه دربالا به آن تصریح شده شامل دو بخش میباشد:

  • بخش پروتئینی موسوم به گلوبین که دارای چهار زنجیرة پلی پپتیدی می باشد (تترامر می باشد).
  • بخش غیر پروتئینی موسوم به هِم (heme) که به آن گروه پروستتیک مولکول هموگلوبین می گویند(جنسن[3] وفرانک 2009).مولکول هِم مسئول رنگ قرمز هموگلوبین و میوگلوبین می باشد ویک اتم آهن دو ظرفیتی در مرکز آن قرار گرفته می باشد. اگر اتم آهن دو ظرفیتی(Fe²+) به آهن سه ظرفیتی(Fe³+) اکسید گردد، عملکرد مولکول از بین خواهد رفت(پین وهمکاران [4]1985). در مولکول هِم هر اتم آهن فرو قادر می باشد 6 پیوند کئوردینانس(داتیو) مستقر سازد. چهار عدد از این پیوندها با اتم های نیتروژن موجود در حلقة پورفیرین مستقر می گردد، که همگی در یک سطح قرار دارند. پیوندهای پنجم وششم نیز در بالا و پایین این سطح قرار دارند. پیوند پنجم بین آهن و نیتروژن یکی از اسیدهای آمینة گلوبین و پیوند ششم بین آهن و مولکول اکسیژن مستقر می گردد. بدیهی می باشد در صورتیکه هموگلوبین، اکسیژن خود را از دست بدهد، پیوند ششم وجود نخواهد داشت (لینبرگ [5]وهمکاران،1998)( شکل 1-1). هر مولکول هِم قادر می باشد یک مولکول اکسیژن را جابجا کند، لذا هر مولکول هموگلوبین توانایی حمل چهار مولکول اکسیژن را داراست ( لینبرگ وهمکاران،1998 ).

 

شکل1-1:زنجیره هاي گلوبین ومولکول هم درهموگلوبین انسانی (پروتز ،1960).

1ـ1ـ3 اظهار تکوینی هموگلوبین

تجزیه وتحلیل هموگلوبین جنین بشر مشخص کردکه اساسا هموگلوبین جنینی ازیک هموگلوبین باتفاوت حرکت الکتروفورزي نسبت به هموگلوبین طبیعی تشکیل شده می باشد که هموگلوبین جنینی یاHbF نامیده می گردد. واکاوی متعاقب نشان داد کهHbF تترامري ازدوزنجیره -α گلوبین ودوزنجیره پلی پپتیدي دیگراست که توالی آن شبیه زنجیره-β گلوبین بوده وگاما(γ) نامیده می گردد.HbF حدود50 درصدازهموگلوبین خون بالغین طبیعی راتشکیل می دهد(بوسالیس[6] وهمکاران ،2011).

ژن هاي گلوبین انسانی در دو دوره زمانی توسعه می یابد. از دوره رویانی(ε) تادوره نوزادی(γ) و از دوره نوزادی(γ) تادوره بلوغ گلوبین می باشد.

فعال شدن هموگلوبین جنینی(HbF) دربزرگسالان یکی ازاستراتژي هاي موثربراي درمان بیماري سلول داسی شکل وبتاتالاسمی می باشد که به عنوان افزایش سطح هموگلوبین جنینی بابهبود علائم دربیماران مبتلابه هموگلوبینوپاتی همراه می باشد.

درانسان سالم هشت نوع مختلف ازهموگلوبین درطی مراحل مختلف رویانی،نوزادي وبلوغ اظهار می گردد. (شکل 1-2) که این نشان دهنده مدل عمده اي از زیست شناسی تکاملی می باشد که توسط تعویض وخاموش وروشن شدن ژن هاي مختلف گلوبین اظهار می شوند(کاپیلینی[7] وهمکاران ،2009).

شکل1-2: اظهار هشت نوع مختلف هموگلوبین درطی مراحل مختلف رویانی، نوزاد ي وبلوغ ازهموگلوبین(کاپیلینی ،2009).

هموگلوبین بالغین (HbA) داراي دوزنجیره آلفاگلوبین و دو زنجیره بتاگلوبین (α2 β2) می باشد. HbA قبل ازهفته 8 تا 10 حاملگی قابل ردیابی نیست، اما بعدازماه سوم حاملگی، 4 تا 13 درصدهموگلوبین، هموگلوبین از نوع HbA می باشد درحالیکه هموگلوبین جنینی(HbF) داراي دوزنجیره آلفاگلوبین ودوزنجیره گاماگلوبین   (α2 γ2) می باشد. هموگلوبین جنینی ازاوایل دوره رویانی قابل نظاره می باشد و سنتزآن به طورسریع افزایش می یابد. بطوريکه درهفته هشتم حاملگی، حداقل 90 درصد هموگلوبین ازاین نوع می باشد ودرطی دوران جنینی و نوزادي به شکل غالب باقی می ماند(مانتووانی[8] وهمکاران، 1988).

تغییر HbF به HbAدرهفته هاي اول زندگی اتفاق می افتد بطوريکه مقدار HbF تا ششمین ماه پس ازتولد به حدود 3% درصدکل هموگلوبین کاهش می یابد و پس ازیک سالگی به کمتراز 2 % می رسد. شروع اختلالات بتاتالاسمی معمولا تا هنگام جایگزینی تولید گلوبین بتا به جاي گامایعنی چند ماه پس ازتولد عیان نمی گردد )مانتووانی وهمکاران، 1988).

مطالعه هموگلوبین جنینی درمراحل اولیه بارداري نشانگر وجود چند فرم مختلف هموگلوبین رویانی، به نامهايHb گاورI ،Hb گاور IIپورتلند رانشان میدادکه درزمان هاي مختلف حاملگی درمقادیرمتفاوت تولیدمی شوند(نصیری، 1389). مطالعه هاي بعدي نشان دادکه این هموگلوبین هاي متفاوت که درطی تکوین به گونه موقتی تولید می شوند درحقیقت تترامرهایی ازترکیب هاي مختلف زنجیره هاي گلوبینα وشبه α ی زتا یاشبه β ی γ یا اپسیلون(ε) هستند(نصیری[9]، 1389) (جدول 1-1).

جدول 1-1: میزان هموگلوبین هاي انسانی درطی دوران مختلف زندگی(نصیری ،1389).

به غیر از اظهار موقتی زنجیره زتا دراوایل زندگی رویانی، ژن زنجیره –αگلوبین درطول تکوین اظهار می گردد. به گونه مشابه اظهار زنجیره-ε گلوبین درابتدای زندگی روی می دهد. اظهار زنجیره γ درطی زندگی جنینی اتفاق می­افتد که با افزایش سطوح اظهار زنجیره –β گلوبین به سمت انتهاي دوران جنینی دنبال می گردد.اظهار ترتیبی این زنجیره ها،تترامرهاي مختلف هموگلوبین رادرطول تکوین نتیجه می­دهد(نصیری، 1389).

1ـ1ـ4 ساختمان زنجیره گلوبین

تعیین توالی های اسیدآمینه های پلی پپتیدهاي گلوبین هاي مختلف دردهه 1960 توسط محققین مختلف انجام گرفت و نشان داد که زنجیره –α گلوبین، 141 و زنجیره β 146 اسیدآمینه طول دارد. مشخص شدکه زنجیره هاي آلفا و بتا یک توالی مشابه اسیدآمینه اي دارند امابه هیچ وجه همسان نیستند. آنالیزتوالی اسیدآمینه زنجیره δ نشان دادکه در 10 اسیدآمینه بازنجیره –β گلوبین فرق دارد(ودرال،2001).

زنجیره هاي آلفادرهمه هموگلوبین هاي انسانی شبیه هم می باشند. زنجیره هاي غیرآلفا شامل زنجیره هاي بتاوزنجیره هاي گاما γ وزنجیره هاي دلتا(δ) می باشد(ودرال،2001). ژن هاي گلوبین دردوخوشه ژنی جداگانه سنتزمی شوندکه یکی ژن هاي آلفاگلوبین یا شبه آلفا می باشد ودیگري مجموعه ژنی ژن بتاگلوبین می باشد (ودرال[10]،2001).

1ـ1ـ5 خوشه ژنی آلفاگلوبین

ژن هاي شبه آلفاگلوبین روي کروموزوم 16 کدمی شوند وترتیب آن روي ژن ازسمت سانترومربه سمت تلومربرروي بازوي کوتاه یابازويP درکروموزوم 16 بصورت می باشد. خوشه ژنی آلفاگلوبین یک منطقه حدودا 70 کیلوبازي را روي بازوي کوتاه کروموزم 16 روی باند P13.3 اشغال می کند (لیچمن [11]و همکاران، 2006) (شکل 1-3)

شکل1-3: سازماندهی خوشه ژنی آلفاگلوبین وبتاگلوبین برروي کروموزوم هاي 16 و 11(کاپیلینی ،2009).

1ـ1ـ6 خوشه ژنی بتاگلوبین

خوشه ژنی بتاگلوبین روي بازوي کوتاه یا بازوي Pکروموزوم 11 قراردارد. خوشه ژنی بتاگلوبین شامل ژن جنینی ε دو ژن گاما γ گلوبین و ژن های دلتا δ وبتا گلوبین می باشد. دو ژن گاماگلوبین به غیر از در کدون شماره 136 دربقیه اسیدآمینه­ها باهم یکسان می باشند. پس، این دو ژن با دو نام Gγ که شامل گلایسین و ژن Aγ که داراي اسیدآمینه آلانین می­باشد و در دوران جنینی اظهار می­شوند ازهمدیگر متمایز می­شوند (گریر[12] و همکاران،2004).

1ـ1ـ7 ناهنجاري هاي هموگلوبين در بشر

هموگلوبینوپاتی ها از بیماري­هاي وراثتی شایع در دنیا می باشند که خاورمیانه نیز از آن مستثنی نیست و در بعضی نقاط خاورمیانه بیش از 10% از جمعیت، حامل یکی از این ژن هاي غیرطبیعی هموگلوبین هستند.

جهش ها در ژن های گلوبین باعث تشکیل پروتئین های غیر طبیعی می شوند که اصطلاحاً واریانت­های هموگلوبین نامیده می شوند (مخرجی[13] وهمکاران، 2005). درحالت طبیعی بعد از تولد، هموگلوبین A1 داراي عملکرد طبیعی و از نظر مقدار، هموگلوبین غالب دربدن می باشد و هموگلوبین­هایی مثل A2 و F با مقادیر بسیار کمتر در کنار آن وجود دارند. مجموعه این هموگلوبین­ها، میزان هموگلوبین کامل فرد را تعیین می کنند. درحالتی که به واسطه جهش، تغییري درتوالی اسیدآمینه هاي هموگلوبین رخ دهد، این ساختار دیگر قادر به انجام عملکردمطلوب خود نبوده و اصطلاحاً هموگلوبینوپاتی به وجود می­آید .بسیاري ازاین هموگلوبین­هاي غیرطبیعی داراي میل ترکیبی بالا با اکسیژن هستند که در حاملین خود پلی سیتمی ایجاد می کنند(مارنگو[14]،2006). تاکنون 1536 نقص در ژن گلوبین شناخته شده می باشد که بسیاري ازآنها با مطالعه حرکت الکتروفورتیک برروي استات سلولز (pH:8.6) وسیترات آگار (pH:6.2) شناسایی می شوند(اولدجم،2007). در ایران هموگلوبینوپاتی­های مختلفی گزارش شده می باشد و در حدود 5% از جمعیت کشور حامل ژن بتاتالاسمی و 1-5/0 % دیگر حاملین انواع دیگرهموگلوبینوپاتی­ها هستند (ارجمندی [15]و همکاران، 2005).

1ـ1ـ8 اختلالات هموگلوبین­های انسانی

اختلالات هموگلوبین­های انسانی را می توان دردوگروه عمده تقسیم بندي نمود:

  • واریانت هاي ساختمانی زنجیره گلوبین
  • بیماري هاي سنتززنجیره هاي گلوبین یا تالاسمی

1ـ1ـ9 واریانت هاي ساختمانی زنجیره گلوبین

در سال 1957 اینگرام نشان داد که تفاوت بین HbSو HbA در جانشینی والین به جاي اسید گلوتامیک در اسیدآمینه شماره 6 درزنجیره بتا گلوبین می باشد. از آن هنگام بیش از 300 واریانت الکتروفورزي هموگلوبین شناسایی شده اند که به دلیل انواع مختلف جهش در این پروتئین ایجاد می شوند(جدول 1-2). حدود 200 مورد از این واریانت هاي الکتروفورزي، جانشینی هاي تک اسیدآمینه هاي حاصل ازیک جهش نقطه اي هستند. اکثریت این ها نادر بوده و با بیماري بالینی همراه نیستند اما تعداد کمی ازآنها با بیماري همراه بوده و در جمعیت هاي خاصی نسبتا شایع هستند (اینگرام[16]،1957)

بعضی از واریانت هاي هموگلوبین بابیماري همراهند، اما بسیاري ازآنها بی ضرر بوده و با عملکرد طبیعی مداخله نمی کنند و فقط در طی دوره هاي مطالعه جمعیتی واریانت هاي الکتروفورزي هموگلوبین شناسایی شده اند. اما به هرحال تعدادي ازآنها به طرق مختلف باعملکرد طبیعی هموگلوبین مداخله می کنند. اگرجهش در درون زیر واحدهاي گلوبین در مجاورت پاکت هاي هم(heme) [17]یا در نواحی تماس بین زنجیره ها رخ دهد میتواند تولید یک مولکول هموگلوبین ناپایدار کند که در گلبول قرمز خون رسوب کرده و به غشاي سلولی آسیب زده و در نتیجه منجر به همولیز سلول گردد. همچنین جهش ها می توانند با عملکرد طبیعی انتقال اکسیژن یا کاهش گرایش به اکسیژن منجربه تولیدیک نوع هموگلوبین گردند که درشکل احیاء شده پایدار می باشد و مت هموگلوبین (Methemoglobin[18])نامیده می­گردد (نصیری،1389).

شما می توانید مطالب مشابه این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

تعداد صفحه :65

قیمت : چهارده هزار و هفتصد تومان

***

—-

پشتیبانی سایت :        ———-        serderehi@gmail.com